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WB實(shí)驗(yàn)失敗是否與緩沖劑有關(guān)
近期了解到有實(shí)驗(yàn)人員反應(yīng),作WB實(shí)驗(yàn)有失敗的情況,懷疑與實(shí)驗(yàn)中使用的緩沖劑有關(guān),可能是緩沖劑未滅菌或配制成溶液后感染了細(xì)菌導(dǎo)致的。那么WB實(shí)驗(yàn)的失敗是否真的與緩沖劑染菌造成的呢? WB實(shí)驗(yàn)即western blot蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn),或稱為免疫印跡實(shí)驗(yàn),是將電泳分離后的細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜或PVDF膜上,然后用特異性抗體檢測(cè)某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)。WB實(shí)驗(yàn)失敗的原因有
上樣緩沖液即loading buffer,是蛋白質(zhì)、核酸DNA與RNA的研究實(shí)驗(yàn)中溶解和添加樣品時(shí)所用的一類上樣緩沖液,蛋白質(zhì)、DNA、RNA是不同的樣品,其上樣緩沖液也有所區(qū)別。 蛋白上樣緩沖液的組成 其緩沖液主要采用Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷鹽酸)或Tris甘氨酸、與EDTA鹽(乙二胺四乙酸二鈉),還需添加SDS,DTT(二流蘇糖醇),溴酚藍(lán),甘油等。 蛋白、DNA、RNA的上樣緩沖液
TRIS-HCL緩沖液很穩(wěn)定,可被廣泛用于生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的緩沖液的制備,它的生理體液的相容性好,與鈣,鎂離子不會(huì)形成沉淀,相反,磷酸鹽與鈣、鎂離子會(huì)產(chǎn)生沉淀。而且相同pH、相同濃度的TRIS-HCL緩沖液的離子強(qiáng)度比磷酸鹽緩沖液的離子強(qiáng)度低。這對(duì)酶類測(cè)定尤為重要。因?yàn)榇箅x子強(qiáng)度易致有些酶失活。因此,有時(shí)用TRIS-HCL代替磷酸鹽緩沖液,效果更好。 但TRIS-HCL緩沖液的pH受溫度
生物緩沖液通常由共軛堿和弱酸或共軛酸和弱堿組成,在很多時(shí)候很多場(chǎng)合都離不開我們的生物緩沖劑。但很多人不知道使用時(shí)需要注意哪些關(guān)鍵因素,下面來大家了解一下。以便后續(xù)在使用時(shí)因這些原因造成的不必要的損失。 1、pKa值 由于大多數(shù)生物反應(yīng)都會(huì)在6-8的pH值之間發(fā)生,因此選擇具有正確pKa值的緩沖液非常重要。在選擇緩沖液之前,有必要弄清楚該實(shí)驗(yàn)適合的pH值水平。 如果在實(shí)驗(yàn)過程中pH值可能會(huì)降低或升高
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